發(fā)布時(shí)間: 2021-07-25 點(diǎn)擊次數(shù): 1118次
對于菌落試驗(yàn)來說按照一般的步驟,可以把每個(gè)菌落挑出來進(jìn)行培養(yǎng)提取質(zhì)粒,然后質(zhì)粒進(jìn)行測序或者酶切驗(yàn)證目的片段。但是從培養(yǎng)細(xì)菌到最后送測序,花費(fèi)太多時(shí)間。如果說只有一個(gè)菌落去驗(yàn)證,那工作量倒不是很大。但萬一有100個(gè)菌落就比較麻煩。那么我們就可以通過
PCR儀進(jìn)行菌落PCR篩選。
基本步驟如下:
1.單菌落挑取
把LB培養(yǎng)基倒入排槍槽中,然后用排槍加400μL LB培養(yǎng)基到48孔深孔板,用鑷子拿已滅菌的小白槍頭挑取平板上的單菌落并放到48孔深孔板中,同時(shí)在48孔深孔板和相應(yīng)的表單上做好記錄,注意對于藍(lán)白斑篩選的板子要挑的是白斑。挑好的48孔深孔板用封口膜蓋好并做好相應(yīng)標(biāo)記(日期、板號等),用針頭在封口膜打孔,把它放在37搖床上搖一個(gè)小時(shí)。
2.菌落PCR反應(yīng)
配置好PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系,把配好的反應(yīng)液加到96孔反應(yīng)板中,用排槍加2.5μL的菌液到其中,注意在96孔反應(yīng)板上做好標(biāo)記。把96孔反應(yīng)板放在PCR儀上蓋好橡膠墊,按照PCR反應(yīng)條件設(shè)置反應(yīng)程序,注意一定要把PCR儀的蓋子蓋緊。
3.瓊脂糖凝膠電泳
一般先配置1.0%-1.2%瓊脂糖凝膠(即稱1.2g的瓊脂糖加100ml的TAE),在96孔反應(yīng)板每個(gè)管中加0.5μL的溴酚藍(lán),震蕩均勻,然后點(diǎn)樣,電泳好的瓊脂糖凝膠拍照,命名保存。
4.判斷陽性克隆并測序
根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖條帶來判斷陽性克隆,把陽性克隆的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),進(jìn)行測序驗(yàn)證,看看是否有*正確的序列。