發(fā)布時(shí)間: 2022-09-26 點(diǎn)擊次數(shù): 1402次
NEB內(nèi)切酶的對(duì)照實(shí)驗(yàn)怎么做
NEB內(nèi)切酶可提供210多種內(nèi)切酶,其中有130多種內(nèi)切酶為重組酶。重組技術(shù)的運(yùn)用,使NEB能在提高內(nèi)切酶的純度及品質(zhì)的同時(shí),削減生產(chǎn)費(fèi)用。
加入酶之前將反應(yīng)混合物混勻,可以用移液槍上下吹打或輕彈管壁,然后在離心機(jī)中快速離心。切忌振蕩混勻。
一般情況下,我們推薦使用5-10單位酶量/μgDNA,基因組DNA用10-20單位酶量消化1小時(shí)。入內(nèi)切酶的量應(yīng)不超過(guò)總體積的10%,以避免甘油過(guò)量引起的星號(hào)活性。貯存液中的添加物和底物溶液中尚存的殘余物(會(huì)導(dǎo)致小體積反應(yīng)出現(xiàn)問(wèn)題。如果在切割底物DNA時(shí)遇到了問(wèn)題,建議加入以下對(duì)照實(shí)驗(yàn):
1、酶切對(duì)照DNA(含有多個(gè)已知內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的DNA,如LambdaDNA或腺病毒-2DNA),以檢測(cè)內(nèi)切酶的活性。
2、如果對(duì)照DNA能夠被切割而實(shí)驗(yàn)中的底物DNA不能,可以將這兩種DNA混合在一起再進(jìn)行酶切,以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用的底物DNA中是否存在抑制反應(yīng)的物質(zhì)。如果確實(shí)存在某種抑制因子(通常為鹽、EDTA或酚),則混合之后對(duì)照DNA也不能被切割。
3、當(dāng)內(nèi)切酶在非zui適條件下使用時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活性。
4、可以通過(guò)以下方法降低星號(hào)活性:使用高保真(HF)內(nèi)切酶、縮短溫育時(shí)間、使用省時(shí)內(nèi)切酶或者增大反應(yīng)體積。